MC-m004 小鼠黑色素瘤细胞 B16
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| 细胞介绍 |
该细胞需要使用 1640 培养基
注意事项：
该细胞产生黑色素，可能会引起培养上清或细胞沉淀呈现灰色或黑色。B16 系
列细胞使用 DMEM 培养时会出现黑色素快速积累，导致细胞不增殖或死亡，因
此该细胞正常扩增期间请使用我库推荐的 RPMI-1640 为基础的培养基。若需要
进行分泌黑色素等后续实验，可更换为 DMEM 培养或参考相关文献。
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| 细胞特性 |
1） 来源：小鼠皮肤；黑色素瘤
2） 形态：纺锤形和上皮样，贴壁生长
3） 含量：>1x106 细胞数
4） 规格：T25 瓶或者 1mL 冻存管包装
5) 用途：仅供科研使用。
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| 运输和保存 |
干冰运输及复苏好存活细胞：（
1）1mL 冻存管包装干冰运输，收
到后-80 度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存
管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。（
2）T25 瓶复苏的存活细
胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作。
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| 细胞接收后的处理 |
1）收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将 T25 瓶置于 37℃培养箱放置约 2-3h，若发
现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们。
2）请在 4 或 5X 显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍照（10×，20
×）各 2-3 张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依
据。
3）贴壁细胞：细胞在 37℃培养箱中放置 2-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁
情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜
下观察细胞的生长密度若在 60%以下，可去除培养瓶中灌液培养基（若有未贴壁
的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中）
,加入新配制的完全培养基 6-8mL，
放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度达 70%-80%以上，可以对细胞进行
传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收。
4）备注：运输用的培养基（灌液培养基）不能再用来培养细胞，请换用按照说
明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。 收到细胞后第一次传代建
议 T25 培养瓶 1：2 传代 。
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| 一．培养基及培养冻存条件准备 |
1）准备 1640 培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。
2）培养条件： 气相：空气，95%；二氧化碳，5%。 温度：37 摄氏度，培养
箱湿度为 70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
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| 二．细胞处理 |
1） 冻存细胞的复苏：：
将含有 1mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含 4-6mL 完
全培养基的离心管中混合均匀。在 1000RPM 条件下离心 3-5min，弃去上清液，
完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）
中 37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2） 细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的 PBS 润洗细胞 1-2 次。
2. 加入 0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA 于培养瓶中（T25 瓶 1-2mL，T75
瓶 2-3mL），置于 37℃培养箱中消化 3-5 分钟（难消化的细胞可以适当延长消化
时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿
回操作台，轻敲几下培养瓶后加入 3-4ml 含 10%FBS 的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在 1000RPM 条件下离心 3-5min，弃去上清液，补加 1-2mL
培养液后吹匀。将细胞悬液按 1：2 的比例分到新 T25 瓶中，添加 6-8ml 按照
说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际
情况按 1:2~1:5 的比例进行。
参考传代周期：3-4 天
参考传代比例：1：4-1：8
参考换液频率：2-3 次/周
3）细胞冻存: 收到细胞后建议在培养前 3 代时冻存一批细胞种子以备后续实验
使用。下面 T25 瓶为例；
1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血
球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为 1×106~1
×107 个活细胞/ml.
2. 1000rpm 离心 3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞 ，按每
1ml 冻存液含 1×106~1×107 个活细胞/ml 分配到一个冻存管中将细胞分配到
冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80 度冰箱中过夜，之后转入液氮容器
中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。
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| 注意事项 |
1. 所有动物细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并
请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需要灭菌后方能丢弃。
2. 建议在复苏冻存细胞时始终使用防护手套、衣服和戴上防护面罩。注意：冻存
管浸没在液氮中会泄漏，并会慢慢充满液氮。解冻时，液氮转化成气相可能导致
容器爆炸或用危险力吹掉其盖子，从而产生飞扬的碎屑造成人员伤害。
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| 参考文献 |
Silagi S, Control of pigment production in mouse melanoma cells in vitro. Evocation and
maintenance.J Cell Biol. 1969 Nov;43(2):263-74 Hu F,Lesney PF, The isolation and cytology of
two pigment cell strains from B-16 mouse melanomas.Cancer Res. 1964 Oct;24:1634-43
RILEY V, Enzymatic determination of transmissible replicating factors associated with mouse tumors. Ann N Y Acad Sci. 1963 Feb 15;100:762-90
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