MCRN40 植物microRNA快速提取试剂盒

室温

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传统的microRNA提取试剂盒均是采用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿（TRIzol法）加高浓度乙醇硅胶膜吸附小片段microRNA的原理方法制成，但是复杂的植物品类如棉花、葡萄、胡杨、冬青、月季、石斛、单参、水稻种子、人参、玉米胚芽等大量样品用TRIzol的原理甚至无法提取符合要求的总RNA，更不用说microRNA。因此包括Qiagen，Invitrogen等世界著名公司采用Trizol法原理的microRNA提取试剂盒面临复杂植物样品时束手无策，产品线中干脆就没有复杂植物microRNA提取试剂盒。用户无奈只好用传统方法，或者TRIzol法提取，用异丙醇/乙醇沉淀方法来提取microRNA，虽然也能提取到部分microRNA，但是沉淀法损失巨大或者和杂质共沉淀，影响实验结果，在国际刊物投稿时常常面临质疑，甚至论文被撤销。而本试剂盒在公司全球领先数百种复杂植物提取的经验基础上（发表文章130多篇，包括人参、雪莲、棉花、胡杨、冬青等各种复杂植物，并获得发明专利授权），创新性的采用了不用苯酚，氯仿的技术路线全球首家解决该问题，可以提取绝大多数复杂植物如棉花、杨树、冬青、月季、丹参等植物microRNA，当然本试剂盒也适用于拟南芥、水稻、小麦、烟草、水稻等各种简单样品。
独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，植物RNA助提剂PLANTaid帮助结合多糖多酚并通过离心去除，然后裂解混合物通过基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA（包括microRNA）被选择性滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列特殊漂洗液快速的漂洗－离心的步骤,将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free H20将纯净RNA（包括microRNA）从硅基质膜上洗脱。
采用分提取操作步骤也可单独纯化富集后的microRNA组分和总RNA（>200 nt）从而得到分离富集的microRNA和RNA。

1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37°C水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

2.不合适的储存于低温（4°C或者－20°C）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15°C－25°C）进行。

3.WashSolution2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。

4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

1.所有的离心步骤均可在室温完成（4°C离心也可以），使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机.

2.需要自备乙醇，β-巯基乙醇，研钵(可选)。

3.样品处理量绝对不要超过基因组清除柱DA和和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

4.裂解液RLTPlus和WashSolution1中含有刺激性化合物，操作时戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5.关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留（DNase消化也无法做到100%无残留），该产品由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，个别特殊情况需要清除微量基因组DNA残留，可使用以下几种DNA酶消化的方式。1)传统DNA酶消化提取的RNA/microRNA，热灭活DNA酶后直接用于后续实验。2)传统DNA酶消化提取的RNA/microRNA，然后使用RNA清洁纯化试剂盒（货号：RN14，但是需要将说明书改动一个地方，第二步加入250μl无水乙醇改成加入700μl无水乙醇)清洁纯化后用于后续实验。3)直接在吸附柱RA上进行DNaseI柱上消化处理。购买DNA酶柱上消化试剂盒(货号：RN34，但是需将说明书的去蛋白液RW1改成WashSolution1)可先索取具体操作说明书。

6.碰到特别复杂多糖多酚，淀粉等次级代谢产物特别丰富的样品，如葡萄果实，水稻种子，裂解液RLTPlus效果不佳的情况下，应该购买专用裂解液CLB。裂解液CLB是本公司为特别复杂的多糖多酚植物样品研发的最强配方，绝大部分裂解液RLTPlus无法提取的复杂样品都可以提取成功。

提示：第一次使用前请先在WashSolution1瓶和WashSolution2/3瓶中加入指定量乙醇。

对于RNA酶或者多酚特别丰富植物组织：操作前在裂解液RLTPlus中加入β-巯基乙醇至终浓度1%，如1mlRLTPlus中加入10μlβ-巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的RLTPlus4°C可放置一个月。

1.直接研磨法（提取简单植物样品推荐此法，但是简单样品也可以用液氮研磨法）:

a.新鲜植物组织称重后取100mg迅速剪成小块放入研钵（冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取100mg放入研钵），加入10体积（1ml）RLTPlus和1体积（100μl）PLANTaid室温下充分研磨成匀浆，注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLTPlus立刻充分接触以抑制RNA酶活性。注：PLANTaid是提取多糖多酚次级代谢产物色素含量丰富的困难样品不可缺少成分。
b.将裂解物转入离心管，剧烈摇晃振荡15秒，13，000rpm离心5-10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid。
c.取480μl裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量，如残留基因组DNA较多，可适当减少取上清量）将裂解物上清加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。
d.立刻接操作步骤的步骤3。

2.液氮研磨法（提取复杂，易降解样品时推荐此法）:

a.取500μl裂解液RLTPlus，转入1.5ml离心管中，加50μlPLANTaid混匀备用。
b.液氮中研磨适量植物组织成细粉后，取50mg细粉转入上述装有RLTPlus和PLANTaid的离心管,立即用手剧烈振荡20秒，充分裂解。
c.用吸头吹打混匀帮助裂解或者剧烈涡旋震荡直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。
d.将裂解物13,000rpm离心5-10分钟，沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PLANTaid。
e.取裂解物上清（在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量）将裂解物上清加到DNA清除柱上（清除柱放在收集管内）。f.立刻接操作步骤的步骤3。

注意：以上液氮研磨法用户可以根据需要加倍处理，可以提高产量。也就是使用1ml的裂解液RLTPlus和100μlPLANTaid和100mg的样品.

3.立即13,000rpm离心60秒，收集滤液（RNA在滤液中）。

4.用微量移液器较精确估计滤过液体积（480μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入1.25倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

5.立刻将混合物(每次小于700μl，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm离心30秒，弃掉废液。确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

6.加700μlWashSolution1（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心30秒，弃掉废液。

7.加入500μlWashSolution2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μlWashSolution2/3，重复一遍。

8.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9.取出吸附柱RA，放入一个RNasefree离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μlRNasefreewater，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟。将洗脱液加回到吸附柱重复洗脱步骤一遍可以提高产量约10-15%。

10.得到的RNA/microRNA可以立即用于下游反应或者尽快置于低温保存。