MCRN46 血清/血浆microRNA快速提取试剂盒

4°C 避光

室温

近年来对RNA干扰和调节性小RNA的广泛研究迫切需要一种能有效提取15­-30核苷酸左右大小RNA（包括siRNA和miRNA）的试剂盒。但是传统的RNA提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和异丙醇或者乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子RNA，对于血清血浆样本更是由于其自身特点更难提取。

本试剂盒采用独特的裂解液迅速直接裂解血清血浆RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA在高浓度乙醇下吸附于离心柱内特殊硅基质膜， 再通过一系列特殊漂洗液快速的漂洗－离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除， 最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2.也不需要乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。

3.特殊的裂解液配方，可以处理更多的血清/血浆样品。

4.多次柱漂洗确保高纯度，可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

1.所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37°C水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

2.不合适的储存于低温（4°C或者－20°C）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15°C－25°C）进行。

3.WashSolution2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。

4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2.也不需要异丙醇或者乙醇沉淀等容易丧失微小分子RNA的步骤。

3.特殊的裂解液配方，可以处理更多的血清/血浆样品。

4.多次柱漂洗确保高纯度，可用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和各种实验。

1.第一次使用前请先在WashSolution1瓶和WashSolution2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

2.除说明外，所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13，000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf5415C或者类似离心机。

3.需要自备乙醇，氯仿。

4.Lysisbuffer和WashSolution1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

5.RNA纯度及浓度检测：一般情况下通过测量OD260值可以知道RNA产量，测量OD260/OD280比值可以是衡量蛋白质污染程度的指标之一，但是由于血清/血浆的RNA含量特别低，已经低于分光光度计测量的下限，无法测量准确，因此一般无法通过测量OD值或者比值的方法来判断纯度或者浓度，只能通过下游做荧光定量RT-PCR来判断产量。同时无细胞的血清/血浆中的RNA主要是小于100nt的小RNA，因此传统的电泳检测RNA完整性并不适用于血清/血浆RNA。

提示：第一次使用前请先在WashSolution1瓶和WashSolution2/3瓶中加入指定量乙醇！

1.每250μl样品(血清，血浆)加入750μlLysisbuffer，涡旋振荡或者用加样枪吹打液体样品几次混匀帮助裂解。对于含有高污染物样品如高蛋白高血脂样品，可以适当减少处理量，不足的体积，可以用去RNase-freeH2O补足。Lysisbuffer和液体样品的终体积比总是3：1。例如200μl样品+50μlRNase-freeH2O+750μlLysisbuffer。

2.将样品剧烈震荡混匀，在15-30°C条件下孵育5分钟。

3.每750μlLysisbuffer加200μl氯仿，剧烈振荡15秒并室温下放置2分钟。

4.于4°C12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加Lysisbuffer体积的70%。

5.小心取上清（精确计算体积）转入到新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇（必须是室温的），涡旋混匀。此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心，立刻接下步。

6.将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm离心30-60秒，弃掉废液。

7.加700μlWashSolution1（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心30秒，弃掉废液。

8.加入500μlWashSolution2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm离心30秒，弃掉废液。加入500μlWashSolution2/3，重复一遍。

9.将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10.取出吸附柱RA，放入一个RNasefree离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-40μlRNasefreewater（事先在100°C水浴中预热效果更好），室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟。洗脱液加回到吸附柱重复洗脱一遍可以提高产量和浓度(如果需要RNA浓度高)。如果需要提高浓度，洗脱体积最小可以低至15μl，但是使用小体积洗脱会降低一些产量。